蛋白含量測定常用方法有哪些?
更新時間:2021-12-29 點擊次數(shù):2001
蛋白純化是目前生物研究鄰域中較為熱門的一個大方向,其中蛋白含量測定是純化過程中很重要的一項內(nèi)容。
zui常用的蛋白含量測定分析方法有:馬斯亮藍(lán)法(Bradford)、Folin-酚試劑法(Lowry)、BCA法等。
Folin-酚試劑法(Lowry):蛋白質(zhì)在堿性溶液中肽鍵與Cu2+鰲合,形成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物,還原酚磷鉬酸,產(chǎn)生藍(lán)色化合物,藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系。靈敏度在1-5μg/mL,是目前zui靈敏的測定方法,但耗費(fèi)時間長,操作需嚴(yán)格計時,顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)而變化,因為其中的酒石酸鉀-硫酸銅試劑配置保存困難,逐漸被考馬斯亮藍(lán)法取dai。
考馬斯亮藍(lán)法(Bradford):考馬斯亮藍(lán)G-250染料與蛋白質(zhì)結(jié)合呈藍(lán)色,在波長595nm有吸收峰,在一定的范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)的含量呈線性關(guān)系。靈敏度在25-250μg/mL左右,應(yīng)用廣泛,顏色穩(wěn)定,專一性較差,干擾物質(zhì)多。
BCA法:BCA法基于雙縮脲原理,堿性條件下蛋白質(zhì)將Cu2+還原成Cu+,BCA鰲合Cu+作為顯色劑,產(chǎn)生藍(lán)紫色并在562nm有吸收峰,單價Cu+與蛋白質(zhì)呈劑量相關(guān)性。靈敏度在0.5-20μg/mL之間,用于快速檢測,抗干擾能力強(qiáng),但受金屬螯合劑影響。
每種測定方法都不是wan美無缺的,都有其優(yōu)缺點,在選擇時應(yīng)考慮:
① 試驗所要求的靈敏度和精確度;
② 蛋白質(zhì)的性質(zhì);
③ 溶液中存在的干擾物質(zhì);
④ 測定時所耗費(fèi)的時間等因素。
就具體情況選擇最合適的試驗方法。